طرز تهیه محیط کشت مولر هینتون براث

بخش ۱: معرفی آگار مولر-هینتون (Mueller Hinton Agar – MHA)

آگار مولر-هینتون (MHA) یک محیط کشت میکروبیولوژیکی است که به یکی از ابزارهای بسیار مهم در میکروب‌شناسی بالینی و تحقیقاتی تبدیل شده است. این محیط به‌طور گسترده به‌عنوان محیط استاندارد برای آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی (Antimicrobial Susceptibility Testing – AST) شناخته می‌شود، به‌ویژه در روش انتشار دیسک کربی-باور (Kirby–Bauer disk diffusion method) که توسط سازمان‌هایی مانند انستیتو استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) و کمیته اروپایی آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST) توصیه شده است.

این محیط به دلیل قابلیت بازتولید، اطمینان و چندکاربردی بودن ارزشمند است. توانایی آن در حمایت از رشد انواع مختلف میکروارگانیسم‌های غیرسخت‌پسند (non-fastidious) و ارائه نتایج پایدار و قابل اعتماد برای آزمایش آنتی‌بیوتیکی، آن را به یک ابزار ضروری در آزمایشگاه‌های تشخیصی تبدیل کرده است.

اهمیت در میکروب‌شناسی

میکروب‌شناسان به محیط‌های استاندارد و قابل اعتماد نیاز دارند، و این اهمیت به دو دلیل اصلی است:

حمایت از رشد (Growth Support): محیط باید بتواند رشد طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌ها را حمایت کند تا بتوان آن‌ها را مطالعه، آزمایش یا نگهداری نمود.
ثبات در آزمایش‌ها (Testing Consistency): حتی تغییرات جزئی در ترکیب محیط می‌تواند نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی را تغییر دهد. MHA محیطی کنترل‌شده و پایدار فراهم می‌کند و تغییرپذیری نتایج را به حداقل می‌رساند.

این قابلیت اطمینان باعث می‌شود MHA فقط یک محیط کشت نباشد، بلکه به معیاری برای مقایسه جهانی تبدیل شود. آزمایشگاه‌های سراسر جهان به استانداردسازی آن اعتماد دارند تا نتایج به‌دست آمده در یک منطقه با نتایج دیگر مناطق قابل مقایسه باشد.

ویژگی‌های عمومی آگار مولر-هینتون

ترکیب: شامل عصاره گوشت گاو، هیدرولیزات کازئین (casein hydrolysate) و نشاسته است. این مواد مغذی شامل پپتیدها، اسیدهای آمینه و منابع انرژی لازم برای رشد باکتری‌ها را فراهم می‌کنند.
pH: معمولاً ۷.۳ ± ۰.۱ در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد تنظیم می‌شود تا محیطی بهینه برای رشد اکثر باکتری‌ها ایجاد شود.
ظاهر: پس از جامد شدن، محیط به رنگ کم‌رنگ و شفاف است.
طبیعت غیرانتخابی (Non-Selective): برخلاف محیط‌های انتخابی، MHA رشد هیچ گونه خاصی از میکروارگانیسم‌ها را مهار نمی‌کند و به همین دلیل برای طیف گسترده‌ای از باکتری‌ها مناسب است.
کمبود مواد مهارکننده (Low Inhibitory Substances): فاقد موادی است که می‌تواند فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها را مختل کند و بنابراین آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی دقیق را تضمین می‌کند.

نقش در آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی

با افزایش تهدید جهانی مقاومت میکروبی به آنتی‌بیوتیک‌ها (Antimicrobial Resistance – AMR) اهمیت روش‌های مطمئن AST بیشتر شده است. MHA به‌عنوان محیط استاندارد طلایی برای این آزمایش‌ها شناخته می‌شود زیرا:

انتشار یکنواخت آنتی‌بیوتیک‌ها را فراهم می‌کند.
مناطق مهار (zones of inhibition) قابل بازتولید در اطراف دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی ایجاد می‌کند.
نشاسته موجود در محیط، سموم باکتریایی را جذب می‌کند و از اختلال در آزمایش جلوگیری می‌نماید.

به عبارت دیگر، بدون MHA، آزمایش انتشار دیسک استاندارد—که سنگ‌بنای میکروب‌شناسی مدرن است—امکان‌پذیر نبود.

کاربردهای فراتر از آزمایش حساسیت

اگرچه MHA بیشتر برای AST شناخته شده است، کاربردهای دیگری نیز دارد:

ایزوله کردن برخی میکروارگانیسم‌های سخت‌پسند (با افزودن مواد غنی‌کننده).
نگهداری کشت‌های ذخیره‌ای (stock cultures).
محیط عمومی برای آموزش و نمایش در آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی.

اهمیت در پزشکی و سلامت عمومی

از دید پزشکی، MHA نقش مستقیم در هدایت درمان با آنتی‌بیوتیک‌ها دارد. نتایج آزمایش حساسیت روی این محیط اغلب تعیین می‌کند:

کدام آنتی‌بیوتیک باید تجویز شود.
آیا سویه‌های مقاوم در حال ظهور هستند یا خیر.
چگونه پروتکل‌های درمانی باید تطبیق یابند.

در حوزه سلامت عمومی، آزمایش‌های مبتنی بر MHA به پایش الگوهای مقاومت کمک می‌کنند و به مقامات بهداشتی امکان می‌دهند مقاومت جهانی میکروبی را ردیابی و به آن پاسخ دهند. بخش ۴: ترکیب آگار مولر-هینتون (Mueller Hinton Agar – MHA)

آگار مولر-هینتون از سه منبع اصلی تغذیه‌ای و یک عامل جامدکننده (آگار) تشکیل شده است. این ترکیب محیطی را ایجاد می‌کند که از نظر تغذیه‌ای حمایتی، از نظر شیمیایی پایدار و عاری از مواد مهارکننده است، و همین ویژگی‌ها آن را برای رشد قابل اعتماد باکتری‌ها و انتشار یکنواخت آنتی‌بیوتیک‌ها ایده‌آل می‌سازد.

۴.۱ مواد اصلی

۴.۱.۱ عصاره گوشت گاو (Beef Extract – ۲.۰ گرم در لیتر)

عملکرد: فراهم کردن ترکیبی پیچیده از اسیدهای آمینه، پپتیدها، ویتامین‌ها و مواد معدنی ریز مشتق از بافت‌های حیوانی.

نقش تغذیه‌ای:

تأمین ویتامین‌های محلول در آب، به‌ویژه ویتامین‌های گروه B، که برای فعالیت‌های آنزیمی ضروری هستند.
ارائه منبع نیتروژن کلی برای رشد باکتری‌ها.
فراهم کردن فاکتورهای رشد که به باکتری‌ها اجازه می‌دهد طیف وسیعی از ارگانیسم‌ها رشد کنند.

اهمیت در AST: چون عصاره طبیعی است، پوشش تغذیه‌ای گسترده‌ای را بدون وارد کردن ترکیبات مهارکننده ارائه می‌دهد.

۴.۱.۲ هیدرولیزات کازئین (Casein Hydrolysate – ۱۷.۵ گرم در لیتر)

عملکرد: کازئین، پروتئین اصلی شیر، به‌صورت آنزیمی هیدرولیز شده تا اسیدهای آمینه، پپتیدهای کوچک و ترکیبات نیتروژنی آزاد شوند.

نقش تغذیه‌ای:

منبع اصلی نیتروژن در MHA است.
ارائه اسیدهای آمینه قابل دسترس برای باکتری‌ها، که باعث می‌شود بدون نیاز به سنتز کامل، رشد کنند.
حمایت از تکثیر سریع باکتری‌ها که در آزمایش آنتی‌بیوتیک اهمیت دارد.

اهمیت در AST: هیدرولیزات کازئین رشد باکتریایی یکنواخت بین گونه‌ها را تضمین می‌کند و تغییرپذیری نتایج آزمایش حساسیت را کاهش می‌دهد.

۴.۱.۳ نشاسته (Starch – ۱.۵ گرم در لیتر)

عملکرد: به‌عنوان عامل خنثی‌کننده سموم عمل می‌کند و سموم باکتریایی آزاد شده در طی رشد را جذب می‌کند.

نقش تغذیه‌ای: منبع کربن کمی برای متابولیسم انرژی فراهم می‌کند، اگرچه نقش اصلی آن تغذیه‌ای نیست.

اهمیت در AST:

جلوگیری از تداخل سموم با فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها.
تضمین می‌کند که مناطق مهار اندازه‌گیری شده، بازتاب واقعی تعامل باکتری و آنتی‌بیوتیک باشند، نه اثرات جانبی سموم.

مزیت منحصربه‌فرد: وجود نشاسته یکی از دلایلی است که MHA را برتر از بسیاری دیگر از محیط‌ها برای AST می‌سازد.

۴.۱.۴ آگار (Agar – ۱۷.۰ گرم در لیتر)

عملکرد: عامل جامدکننده مشتق از جلبک دریایی.

ویژگی‌ها:

در دمای حدود ۱۰۰°C ذوب می‌شود و در ۴۵°C جامد می‌گردد.
ایجاد یک شبکه ژل پایدار که اجازه می‌دهد آنتی‌بیوتیک‌ها به‌طور یکنواخت منتشر شوند.

اهمیت در AST:

ضخامت آگار (۴ میلی‌متر توصیه می‌شود) حیاتی است —
- باریک باشد → آنتی‌بیوتیک بیش از حد منتشر می‌شود و مناطق مهار بزرگ‌تر نشان داده می‌شوند.
- ضخیم باشد → انتشار محدود می‌شود و مناطق مهار کوچک‌تر به نظر می‌رسند.
غلظت آگار متعادل شده است تا نرخ انتشار طبیعی دارو را شبیه‌سازی کند.

۴.۲ ویژگی‌های شیمیایی

pH: تنظیم شده به ۷.۳ ± ۰.۱ در دمای ۲۵°C
- pH کمی قلیایی رشد اکثر باکتری‌های غیرسخت‌پسند را بهینه می‌کند.
- تغییرات pH می‌تواند فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها را تغییر دهد:
  - pH اسیدی → کاهش فعالیت آمینوگلیکوزیدها، کوینولون‌ها، ماکرولیدها
  - pH قلیایی → کاهش فعالیت تتراسایکلین‌ها
محتوای کاتیون‌ها (Ca²⁺, Mg²⁺):
- افزایش بیش از حد کاتیون‌های دوظرفیتی می‌تواند فعالیت آمینوگلیکوزیدها و تتراسایکلین‌ها را کاهش دهد.
- سطوح پایین → فعالیت این آنتی‌بیوتیک‌ها را بیش از حد نشان می‌دهد.
- بنابراین، MHA با کنترل کاتیون (Cation-adjusted MHA) برای **AST استاندارد تولید می‌شود.
شفافیت: محیط نسبتاً شفاف است و مشاهده مناطق مهار را آسان می‌کند.

۴.۳ فرمول معمولی MHA (به ازای هر لیتر)

ماده	میزان (g/L)	عملکرد
عصاره گوشت گاو	۲.۰	ویتامین‌ها، مواد معدنی، فاکتورهای رشد
هیدرولیزات کیسئین	۱۷.۵	اسیدهای آمینه، پپتیدها، منبع نیتروژن
نشاسته	۱.۵	جذب سموم، جلوگیری از تداخل
آگار	۱۷.۰	عامل جامدکننده، حمایت از انتشار آنتی‌بیوتیک
pH نهایی	۷.۳ ± ۰.۱	حفظ پایداری آنتی‌بیوتیک‌ها

۴.۴ دلیل کارآمدی این ترکیب در AST

تغذیه متعادل: رشد گسترده باکتری‌ها را بدون ترجیح دادن گونه خاصی حمایت می‌کند.
غیرمهارکننده بودن: هیچ ترکیبی مانند نمک‌های صفراوی یا رنگ‌ها که فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها را تحت تأثیر قرار دهد، ندارد.
انتشار کنترل‌شده: غلظت آگار و pH انتشار داروها را قابل پیش‌بینی می‌کند.
خنثی‌سازی سموم: نشاسته محصولات جانبی که ممکن است نتایج را مخدوش کنند را جذب می‌کند.
استانداردسازی: فرمول در سراسر جهان یکسان است و نتایج قابل مقایسه بین آزمایشگاه‌ها را تضمین می‌کند.

۴.۵ تغییرات در ترکیب

اگرچه فرمول اصلی ثابت است، برخی تولیدکنندگان تعدیلاتی اضافه می‌کنند:

خون (۵٪ خون گوسفند) → برای باکتری‌های سخت‌پسند
NAD یا همین (Hemin) → برای Haemophilus influenzae
کنترل اضافی کاتیون‌ها → برای برخی آنتی‌بیوتیک‌ها

با این حال، فرمول پایه بدون تغییر باقی می‌ماند و قابلیت مقایسه جهانی حفظ می‌شود.

بخش ۵: آماده‌سازی آگار مولر-هینتون (Mueller Hinton Agar – MHA)

۵.۱ اهمیت آماده‌سازی صحیح

آگار مولر-هینتون به‌عنوان محیط استاندارد طلایی در آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی (AST) شناخته می‌شود. با این حال، قابلیت اعتماد آن به شدت به آماده‌سازی یکنواخت و دقیق وابسته است.
تغییرات در ضخامت، pH، غلظت کاتیون‌ها یا استریلیته می‌تواند منجر به نتایج کاذب حساسیت یا مقاومت شود و در محیط‌های بالینی باعث تفسیر نادرست گردد.

۵.۲ مواد مورد نیاز

پودر آگار مولر-هینتون (در دسترس تجاری، تولیدکنندگانی مانند HiMedia، Oxoid، BD Difco).
آب مقطر یا دیونیزه شده (عاری از هرگونه آلودگی که رشد باکتری‌ها را مختل کند).
ظروف شیشه‌ای استریل (بالن، استوانه مدرج، پیپت).
پی‌اچ‌متر یا نوارهای شاخص pH کالیبره شده.
اتوکلاو (برای استریل کردن محیط).
هود لامینار یا محیط کاری تمیز (برای حفظ استریلیته هنگام ریختن محیط).
پتری دیش (Petri dishes) (پلاستیکی یک‌بار مصرف یا شیشه‌ای قابل استفاده مجدد).

۵.۳ فرمول استاندارد (به ازای هر لیتر محیط)

ماده	میزان (g/L)
عصاره گوشت گاو	۲.۰
هیدرولیزات کیسئین	۱۷.۵
نشاسته	۱.۵
آگار	۱۷.۰
pH نهایی	۷.۳ ± ۰.۱ در ۲۵°C

توضیح: تولیدکنندگان تجاری معمولاً این محصول را به شکل پودر خشک ارائه می‌دهند و دستورالعمل ترکیب مجدد با آب را ارائه می‌کنند.

۵.۴ مراحل آماده‌سازی

مرحله ۱: توزین و حل کردن

مقدار لازم از پودر خشک MHA را وزن کنید (معمولاً ۳۸ گرم در هر لیتر).
پودر را در ۱ لیتر آب مقطر در یک بالن مخروطی تمیز معلق کنید.
هم بزنید تا پودر کاملاً حل شود.
محلول ممکن است کمی کدر به نظر برسد اما نباید گلوله یا توده‌ای داشته باشد.

مرحله ۲: تنظیم pH

pH محلول را با پی‌اچ‌متر اندازه‌گیری کنید.
تنظیم pH به ۷.۳ ± ۰.۱ در ۲۵°C
- برای افزایش pH → از NaOH 1N استفاده کنید
- برای کاهش pH → از HCl 1N استفاده کنید
پس از تنظیم، pH را دوباره بررسی کنید.

⚠️ نکته مهم: pH بسیار حیاتی است؛ حتی انحرافات کوچک می‌تواند فعالیت برخی آنتی‌بیوتیک‌ها مانند تتراسایکلین‌ها و آمینوگلیکوزیدها را تغییر دهد.

مرحله ۳: استریل‌سازی

محیط را در بطری‌ها یا بالن‌های قابل اتوکلاو منتقل کنید.
اتوکلاو در ۱۲۱°C به مدت ۱۵ دقیقه با فشار ۱۵ psi.
اجازه دهید محیط تا دمای ۴۵–۵۰°C خنک شود قبل از ریختن در ظرف پتری.

مرحله ۴: ریختن صفحات

در هود لامینار استریل یا نزدیک شعله بونسن، محیط را در ظرف‌های پتری استریل بریزید.
ضخامت توصیه‌شده: حدود ۴ میلی‌متر (~۲۵ میلی‌لیتر در یک ظرف پتری استاندارد ۹۰ میلی‌متر).
- باریک‌تر: مناطق مهار بزرگ‌تر → حساسیت کاذب
- ضخیم‌تر: مناطق مهار کوچک‌تر → مقاومت کاذب
اجازه دهید صفحات در دمای اتاق جامد شوند.

مرحله ۵: خشک کردن و نگهداری

صفحات باید در یک محیط استریل با درپوش نیمه‌باز خشک شوند تا رطوبت سطحی از بین برود.
نگهداری در دمای ۲–۸°C (یخچال) و در کیسه‌های پلاستیکی مهر و موم شده برای جلوگیری از خشک شدن.
صفحات باید حداکثر تا ۷ روز استفاده شوند (یا طبق توصیه تولیدکننده).

۵.۵ بررسی‌های کنترل کیفیت

برای اطمینان از یکنواختی، هر دسته MHA باید تحت آزمایش کنترل کیفیت قرار گیرد:

تست استریل بودن:
- یک صفحه تلقیح نشده را در ۳۵–۳۷°C به مدت ۲۴–۴۸ ساعت انکوبه کنید.
- بررسی آلودگی.
تست عملکرد (رشد و مهار):
- سویه‌های مرجع استاندارد را تلقیح کنید (E. coli ATCC 25922، S. aureus ATCC 25923).
- دیسک‌های آنتی‌بیوتیک را قرار دهید و بررسی کنید که قطر مناطق مهار در محدوده قابل قبول CLSI/EUCAST باشد.
- در صورت انحراف، محیط نباید برای تست بالینی استفاده شود.
بررسی فیزیکی:
- اطمینان از شفافیت، سفتی و ضخامت یکنواخت صفحات.
- سطح باید مرطوب اما غرقاب نشده باشد.

۵.۶ آماده‌سازی‌های ویژه

MHA مکمل‌شده با خون:
- ۵٪ خون گوسفند بدون فیبرین پس از اتوکلاو و خنک شدن (۴۵–۵۰°C) اضافه می‌شود.
- برای Streptococcus pneumoniae و دیگر باکتری‌های سخت‌پسند.
MHA با مکمل‌های NAD و همین:
- برای آزمایش حساسیت Haemophilus influenzae ضروری است.
MHA با کنترل کاتیون‌ها (Cation-Adjusted):
- فرمول‌های تجاری سطح Ca²⁺ و Mg²⁺ استاندارد را تضمین می‌کنند تا AST با آمینوگلیکوزیدها، تتراسایکلین‌ها و پلی‌میکسین‌ها دقیق باشد.

۵.۷ اشتباهات رایج در آماده‌سازی

عمق نامناسب آگار: ضخیم‌تر یا باریک‌تر بودن نرخ انتشار آنتی‌بیوتیک را تغییر می‌دهد و منجر به نتایج کاذب می‌شود.
خطا در pH: حتی انحرافات کوچک فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها را اشتباه نشان می‌دهد.
نگهداری نادرست: صفحات خشک یا دارای رطوبت بیش از حد نتایج ناپایدار تولید می‌کنند.
آلودگی: استریل‌سازی ناکافی یا تکنیک غیر استریل قابلیت اعتماد محیط را کاهش می‌دهد.

۵.۸ اتوماسیون در آزمایشگاه‌های مدرن

بسیاری از آزمایشگاه‌های بالینی اکنون از صفحات MHA از پیش ریخته شده و تجاری استفاده می‌کنند تا تغییرپذیری کاهش یابد.
دستگاه‌های ریختن خودکار و سیستم‌های کنترل کیفیت در آزمایشگاه‌های با حجم بالا استفاده می‌شوند.
با وجود اتوماسیون، اصول آماده‌سازی همانند گذشته باقی می‌ماند و تضمین می‌کند که نتایج با استانداردهای CLSI/EUCAST مطابقت داشته باشند.

بخش ۶: اصلاحات آگار مولر-هینتون (Mueller Hinton Agar – MHA)

۶.۱ چرا آگار مولر-هینتون را اصلاح می‌کنیم؟

اگرچه MHA استاندارد برای بسیاری از باکتری‌های غیرسخت‌پسند مانند E. coli، Pseudomonas aeruginosa، Staphylococcus aureus مناسب است، برخی باکتری‌ها نیاز به مواد مغذی اضافی یا شرایط ویژه دارند.
اگر این نیازها برآورده نشود، ممکن است:

رشد باکتری متوقف شود
یا نتایج AST نشان‌دهنده حساسیت کاذب شود

بنابراین، MHAهای اصلاح‌شده توسعه یافتند تا:

رشد باکتری‌های سخت‌پسند را حمایت کنند
تأثیر غلظت کاتیون‌ها را اصلاح کنند
تست برای آنتی‌بیوتیک‌های خاص را امکان‌پذیر سازند
دقت و قابلیت بازتولید نتایج در شرایط بالینی ویژه را افزایش دهند

۶.۲ اصلاحات رایج

۶.۲.۱ آگار مولر-هینتون با خون (Blood-Supplemented MHA)

ترکیب: MHA استاندارد + ۵٪ خون گوسفند بدون فیبرین
هدف: حمایت از رشد باکتری‌های گرم مثبت سخت‌پسند
موارد استفاده:
- Streptococcus pneumoniae
- گونه‌های بتا-همولیتیک استرپتوکوک
مزایا: ارائه هیمین، NAD و دیگر عوامل رشد
ارتباط با AST: CLSI و EUCAST این محیط را برای تست انتشار دیسک S. pneumoniae توصیه می‌کنند

۶.۲.۲ آگار مولر-هینتون شکلاتی (Chocolate MHA)

ترکیب: MHA استاندارد + خون حرارت داده شده (Chocolate agar)
هدف: حرارت دادن باعث از بین رفتن گلبول‌های قرمز و آزاد شدن NAD (عامل V) و هیمین (عامل X) می‌شود
موارد استفاده:
- Haemophilus influenzae
- Neisseria gonorrhoeae
ارتباط با AST: برای باکتری‌هایی که به خوبی روی MHA بدون مکمل رشد نمی‌کنند ضروری است

۶.۲.۳ آگار مولر-هینتون با کنترل کاتیون‌ها (Cation-Adjusted MHA – CA-MHA)

اصلاح: استانداردسازی غلظت یون‌های کلسیم (Ca²⁺) و منیزیم (Mg²⁺)
هدف: جلوگیری از نتایج کاذب AST
نمونه‌ها:
- غلظت بالای کاتیون‌ها → کاهش فعالیت آمینوگلیکوزیدها و تتراسایکلین‌ها
- غلظت پایین کاتیون‌ها → افزایش فعالیت و حساسیت کاذب
ارتباط با AST: CLSI CA-MHA را برای انتشار دیسک و میکروتراوش شریطی الزامی می‌داند

۶.۲.۴ آگار مولر-هینتون با گلیسرول

ترکیب: MHA استاندارد + گلیسرول
هدف: تقویت رشد برخی سویه‌های محیطی یا دامپزشکی
کم‌تر رایج: بیشتر در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی استفاده می‌شود تا آزمایش‌های بالینی

۶.۲.۵ آگار مولر-هینتون با کاهش غلظت آگار

اصلاح: کاهش درصد آگار (~۱.۵٪ به جای ۱.۷٪)
هدف: بهبود انتشار آنتی‌بیوتیک‌های مولکول بزرگ (مثل گلیکوپپتیدها مانند وانکومایسین)
ارتباط با AST: به ندرت در آزمایشگاه‌های بالینی معمول استفاده می‌شود، اما در تحقیقات ویژه مهم است

۶.۲.۶ آگار مولر-هینتون با مکمل‌های جایگزین

نمونه‌ها:
- خون اسب + β-NAD → طبق دستورالعمل EUCAST برای Haemophilus influenzae
- خون اسب لیز شده → جایگزین خون گوسفند در برخی آزمایشگاه‌های اروپایی
هدف: تطابق با دسترس‌پذیری منطقه‌ای و راهنمای خاص

۶.۳ کاربردهای MHAهای اصلاح‌شده

محیط اصلاح‌شده	باکتری هدف	کاربرد
MHA + ۵٪ خون گوسفند	Streptococcus pneumoniae	انتشار دیسک
Chocolate MHA	Haemophilus influenzae، Neisseria gonorrhoeae	AST باکتری‌های سخت‌پسند
CA-MHA	باکتری‌های مختلف	AST استاندارد (آمینوگلیکوزیدها، تتراسایکلین‌ها، کولستین)
MHA + گلیسرول	باکتری‌های محیطی	استفاده تحقیقاتی
MHA با آگار کاهش‌یافته	کوکسی‌های گرم مثبت، تست گلیکوپپتید	AST تخصصی

۶.۴ توصیه‌های CLSI و EUCAST درباره اصلاحات

CLSI (ایالات متحده):

برای انتشار دیسک و میکروتراوش شریطی، CA-MHA الزامی است
برای Streptococcus pneumoniae → MHA + ۵٪ خون گوسفند توصیه می‌شود
برای Haemophilus influenzae → Chocolate MHA با مکمل‌ها توصیه می‌شود

EUCAST (اروپا):

استفاده از MHA + ۵٪ خون اسب بدون فیبرین + ۲۰ mg/L β-NAD برای Haemophilus influenzae
استفاده از MHA با خون اسب لیز شده برای برخی گونه‌های استرپتوکوک
رعایت دقیق عمق آگار و غلظت کاتیون‌ها الزامی است

این اصلاحات نشان می‌دهد که چگونه مناطق مختلف جهان MHA را تطبیق می‌دهند در حالی که قابلیت مقایسه جهانی حفظ می‌شود.

۶.۵ مزایا و محدودیت‌های اصلاحات

مزایا:

افزایش دامنه باکتری‌هایی که می‌توان به طور قابل اعتماد تست کرد
بهبود قابلیت بازتولید نتایج AST
حمایت از هماهنگی جهانی در حالی که نیازهای ویژه باکتری‌ها رعایت می‌شود

محدودیت‌ها:

افزودن مکمل‌ها هزینه را افزایش می‌دهد
عمر مفید کوتاه‌تر (به ویژه با خون یا NAD)
آماده‌سازی و کنترل کیفیت کمی پیچیده‌تر
نیاز به رعایت دقیق دستورالعمل‌ها (تفاوت CLSI و EUCAST)

۶.۶ مسیرهای آینده در اصلاحات MHA

MHA کروموژنیک: فرمول‌های آزمایشی که در پاسخ به رشد باکتری یا مکانیزم‌های مقاومت، رنگ تغییر می‌دهند
نسخه‌های High-Throughput: سازگار با سیستم‌های AST خودکار
MHA هیبرید انتخابی: ترکیب MHA با عوامل انتخابی برای شناسایی مستقیم پاتوژن‌های مقاوم در نمونه‌های مخلوط

این نوآوری‌ها تلاش می‌کنند سادگی و قابلیت اعتماد MHA را حفظ کنند و همزمان آن را برای چالش‌های مدرن میکروبیولوژی، به ویژه در مبارزه با مقاومت آنتی‌بیوتیکی تطبیق دهند.

بخش ۹: مزایا، معایب و محدودیت‌های آگار مولر-هینتون (Mueller Hinton Agar – MHA)

۹.۱ مزایای MHA

استاندارد جهانی:

MHA به‌عنوان رسانه مرجع جهانی برای تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی (AST) شناخته شده و توسط CLSI و EUCAST تأیید شده است.
امکان مقایسه نتایج بین آزمایشگاه‌ها و کشورهای مختلف را فراهم می‌کند.

رشد طیف وسیع باکتری‌ها:

از رشد بیشتر باکتری‌های غیرسخت‌پسند حمایت می‌کند.
حداقل مواد مهاری → نتایج قابل اعتماد در طیف وسیعی از باکتری‌ها.

انتشار یکنواخت آنتی‌بیوتیک:

عمق و غلظت آگار، انتشار پیش‌بینی‌پذیر داروها را تضمین می‌کند.
این امر برای اندازه‌گیری دقیق مناطق مهار (inhibition zones) حیاتی است.

خنثی‌سازی سموم:

نشاسته محصولات جانبی باکتریایی که ممکن است فعالیت آنتی‌بیوتیک را تحت تأثیر قرار دهند، جذب می‌کند.

شفافیت:

صفحات شفاف هستند و اندازه‌گیری مناطق مهار به راحتی انجام می‌شود.

اقتصادی بودن:

نسبتاً ارزان برای آماده‌سازی
امکان تولید انبوه دارد و حتی در محیط‌های با منابع محدود قابل دسترس است.

انعطاف‌پذیری برای اصلاحات:

می‌توان آن را با خون، NAD، هیمین، یا تنظیم کاتیون‌ها برای باکتری‌های سخت‌پسند یا آنتی‌بیوتیک‌های خاص اصلاح کرد.

ارزش آموزشی:

ابزار عالی برای آموزش میکروبیولوژی و اصول AST است.

۹.۲ محدودیت‌های MHA

نامناسب برای همه باکتری‌ها:

باکتری‌های سخت‌پسند مانند Haemophilus influenzae، Neisseria gonorrhoeae، Streptococcus pneumoniae نیاز به اصلاحات غنی‌تر دارند.

طراحی نشده برای بی‌هوازی‌ها یا قارچ‌ها:

MHA از باکتری‌های هوازی حمایت می‌کند اما از بی‌هوازی‌های مطلق یا قارچ‌ها که به محیط‌های تخصصی نیاز دارند، پشتیبانی نمی‌کند.

محتوای محدود مواد مغذی:

MHA عمدتاً کم‌تکمیل است تا تداخل با تست AST ایجاد نشود؛ بنابراین برخی ارگانیسم‌ها رشد کامل ندارند.

حساسیت به عمق آگار:

حتی تغییرات جزئی در ضخامت آگار می‌تواند الگوهای انتشار دارو را به طور قابل توجهی تغییر دهد.

حساسیت محیطی:

نیاز به کنترل دقیق نگهداری (۲–۸°C، محافظت در برابر خشک شدن) دارد.
تغییرات pH می‌تواند فعالیت داروها را تغییر دهد (مثلاً تتراسایکلین‌ها در pH قلیایی، آمینوگلیکوزیدها در pH اسیدی).

۹.۳ معایب MHA

عدم انعکاس شرایط واقعی بدن:

AST روی MHA به طور کامل شرایط بدن انسان (پروتئین‌های سرم، تعاملات ایمنی) را شبیه‌سازی نمی‌کند.
همیشه با نتایج بالینی به طور کامل مطابقت ندارد.

خطر تفسیر نادرست:

آماده‌سازی نادرست (عمق آگار، غلظت کاتیون، pH) → نتایج حساسیت یا مقاومت کاذب

عمر کوتاه صفحات اصلاح‌شده:

نسخه‌های با خون یا NAD پایداری کمتری دارند.

نیاز به کار دستی:

تست Kirby–Bauer سنتی روی MHA نسبت به سیستم‌های خودکار زمان‌بر است.

محدودیت در تشخیص مدرن:

روش‌های مولکولی (PCR، WGS) اطلاعات سریع‌تر درباره مکانیزم‌های مقاومت ارائه می‌دهند.
MHA هنوز ضروری است اما نمی‌تواند به تنهایی ژن‌های مقاومت را شناسایی کند.

بخش ۱۰: پرسش‌های متداول (FAQs)

سؤال ۱: چرا MHA برای تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی استفاده می‌شود؟

چون انتشار یکنواخت آنتی‌بیوتیک دارد، حداقل مواد مهاری دارد و مناطق مهار قابل بازتولید تولید می‌کند.

سؤال ۲: آیا باکتری‌های سخت‌پسند روی MHA رشد می‌کنند؟

روی MHA استاندارد به خوبی رشد نمی‌کنند. نیاز به اصلاحات خون، NAD یا آگار شکلاتی دارند.

سؤال ۳: MHA با تنظیم کاتیون چیست؟

فرمولی که Ca²⁺ و Mg²⁺ کنترل شده‌اند تا از حساسیت یا مقاومت کاذب جلوگیری شود.

سؤال ۴: صفحات MHA تا چه مدت قابل نگهداری هستند؟

معمولاً تا ۷ روز در دمای ۲–۸°C در صورت بسته‌بندی صحیح؛ بعضی آزمایشگاه‌ها با کنترل کیفیت دقیق تا ۲ هفته نگه می‌دارند.

سؤال ۵: آیا MHA انتخابی یا تفکیکی است؟

نه. MHA غیرانتخابی و غیرتفکیکی است و رشد عمومی باکتری‌ها را حمایت می‌کند.

سؤال ۶: اگر عمق آگار نادرست باشد چه اتفاقی می‌افتد؟

خیلی نازک (<۴ mm): مناطق بزرگ → حساسیت کاذب
خیلی ضخیم (>۴ mm): مناطق کوچک → مقاومت کاذب

سؤال ۷: آیا MHA برای آموزش استفاده می‌شود؟

بله، در آموزش میکروبیولوژی و نمایش اصول AST و مقاومت به طور گسترده استفاده می‌شود.

سؤال ۸: آیا MHA از باکتری‌های بی‌هوازی حمایت می‌کند؟

خیر، بی‌هوازی‌ها به محیط‌های تخصصی نیاز دارند (مثل آگار خون بی‌هوازی).

سؤال ۹: آیا MHA در میکروبیولوژی غذا یا دامپزشکی استفاده می‌شود؟

بله، به ویژه برای بررسی مقاومت آنتی‌بیوتیکی باکتری‌های غذایی و ایزوله‌های دامپزشکی.

سؤال ۱۰: آیا MHA هنوز در عصر تشخیص مولکولی مرتبط است؟

مطمئناً. PCR و توالی‌یابی ژن‌های مقاومت را شناسایی می‌کنند، اما AST روی MHA نشان می‌دهد آیا این ژن‌ها به طور واقعی باعث مقاومت می‌شوند.

بخش ۱۱: نتیجه‌گیری

آگار مولر-هینتون (MHA) یکی از مهم‌ترین محیط‌های کشت در میکروبیولوژی است. از زمان توسعه آن توسط John Howard Mueller و Jane Hinton در سال ۱۹۴۱، به استاندارد طلایی برای تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی تبدیل شده و اساس روش انتشار دیسک Kirby–Bauer را شکل داده است.

ترکیب آن — عصاره گوشت، هیدرولیزات کازئین، نشاسته و آگار — تعادل ایده‌آل بین مواد مغذی، پایداری و خنثی‌سازی سموم را برای نتایج قابل بازتولید AST فراهم می‌کند. استانداردسازی این محیط اطمینان می‌دهد که آزمایشگاه‌ها در سراسر جهان می‌توانند نتایج قابل مقایسه تولید کنند، و آن را برای میکروبیولوژی بالینی، بهداشت عمومی و پایش مقاومت آنتی‌بیوتیکی ضروری می‌سازد.

با وجود برخی محدودیت‌ها (رشد باکتری‌های سخت‌پسند، حساسیت به عمق آگار، عدم انتخابی بودن)، MHA در نقش خود بی‌رقیب باقی مانده است. قابلیت تطبیق آن از طریق اصلاحات خون، آگار شکلاتی، تنظیم کاتیون امکان استفاده از آن برای پاتوژن‌های باکتریایی متنوع را فراهم کرده است.

در دنیایی که با بحران رو به رشد مقاومت آنتی‌بیوتیکی مواجه است، MHA همچنان ابزاری حیاتی در تشخیص بالینی باقی مانده است. این محیط نه تنها در درمان بیماران راهنمایی می‌کند بلکه امکان پایش جهانی روند مقاومت را نیز فراهم می‌سازد. حتی با پیشرفت روش‌های مولکولی و خودکار، MHA به عنوان یک رسانه مرجع قابل اعتماد، ساده، مقرون‌به‌صرفه و استاندارد جهانی باقی می‌ماند.

خلاصه: آگار مولر-هینتون فقط یک محیط کشت نیست؛ بلکه ستون پزشکی مدرن است که میز آزمایشگاه را به خط مقدم مراقبت از بیماران و بهداشت عمومی متصل می‌کند.